Evaluarea microARN-urilor din încărcătura exosomală în vederea identificării mecanismelor de rezistență la terapie în cancerul de sân triplu negativ - SUNRISE
- Detalii
- Accesări: 859
Titlul proiectului: Evaluarea microARN-urilor din încărcătura exosomală în vederea identificării mecanismelor de rezistență la terapie în cancerul de sân triplu negativ
Acronim: SUNRISE
Competiție: P1 - Dezvoltarea sistemului național de CD - Proiect de cercetare postdoctorală (PD)
Cod proiect : PN-III-P1-1.1-PD-2021-0471
Contract de finantare nr. PD44/2022
Durata proiect : 01.04.2022 - 31.03.2024
Buget : 250.000 LEI
Coordonator : Universitatea de Medicină și Farmacie “Iuliu Hațieganu“, Cluj-Napoca – RO, Departament – Centrul de Cercetări pentru Genomică Funcțională, Biomedicină și Medicină Translațională
Director de proiect : CSIII Dr Jurj Maria-Ancuța
Mentor: Prof. Univ. Dr. Ciuleanu Tudor Eliade
Motivația proiectului
La nivel global, cancerul de sân este una dintre cele mai frecvente malignități, reprezentând o cauză principală de morbiditate și mortalitate în rândul femeilor. Un subtip important de cancer de sân este reprezentat de cancerul de sân triplu negativ (TNBC). Deși reprezintă doar 15 - 20% din cazurile de cancer de sân, acesta este subtipul de cancer de sân asociat cu o mortalitate marcată datorată rezistenței la terapie și a recidivelor frecvente. Un rol important în acest context este reprezentat de micromediul tumoral și comunicarea acestuia cu clona malignă prin intermediul exosomilor. Exosomii sunt elemente cheie in medierea comunicării intercelulare, prin transportul moleculelor biologice de la celulele donor la celulele țintă. Una dinre speciile moleculare transportate de exosomi este reprezentată de microARN-uri, acestea oferind o reală oglindă a profilului molecular al celulei donoare. Proiectul are la bază identificarea de noi căi de semnalizare care să ajute la contracararea mecanismelor de rezistență la terapia cu doxorubicină în TNBC, precum și determinarea unor potențiali biomarkeri care să prezică rezistența la doxorubicină în cazul pacientelor cu TNBC.
Obiectivele proiectului
Principalele obiective ale proiectului propus sunt următoarele:
1. Analiza microARN-urilor în exosomii izolați din celulele de TNBC (sensibile și rezistente la terapia cu doxorubicină) și fibroblaști, punându-se accent pe nivelele alterate de microARN în legătură cu rezistența la terapie.
2. Determinarea efectului dat de fibroblaști asupra biologiei celulelor de TNBC sensibile la terapie, arătând modularea rezistenței la doxorubicină prin transferul exosomilor și a factorilor solubili secretați de fibroblaști.
Etapele proiectului:
Etapa 1 (data etapă 31.12.2022) - Scurt raport 2022
• Analiza microARN-urilor în exosomii izolați din liniile celulare de cancer de TNBC rezistente și sensibile la terapia cu doxorubicină și fibroblaști, concentrându-ne pe nivelele alterate de microARN în legătură cu rezistența la terapie.
• Determinarea efectului pe care îl prezintă fibroblaștii asupra biologiei celulelor de TNBC sensibile la terapie, arătând modularea rezistenței la doxorubicină prin transferul exosomilor și a factorilor solubili secretați de fibroblaști.
• Evaluarea transcripților non-codificatori alterați (microARN) la nivelul exosomilor izolați din plasma pacienților cu TNBC, ca markeri în predicția rezistenței la terapie. Aprobarea comisiei de etică. Managementul proiectului.
Rezultate obținute în proiect. Etapa 1/2022
(1) Obținerea exosomilor din liniile celulare de TNBC și din fibroblaști.
Această etapă de obținere a exosomilor presupune colectarea mediul condiționat de cultură după 48 de ore de la cultivare, fiind urmat de ultracentrifugare la 109 000xg timp de 2 ore la 4˚C. Veziculele extracelulare obținute în urma ultracentrifugării sunt caracterizate prin Nanosight (pentru a determina dimensiunea și concentrația exosomilor), microscopia electronică de transmisie (pentru a oferi informații despre morfologia particulelor) și Western Blot (pentru a confirma prezența următorilor markeri specifici pentru exosomi: CD9, CD63, CD81). Rezultatele obținute arată că exosomii izolați din mediul de cultură au dimensiuni sub 150nm, morfologie de “cup-shape” și prezența celor trei protein specifice (CD9, CD63 și CD81).
(2) Evaluarea nivelului de expresie a microARN-urilor prin platforma microarray.
După etapa de caracterizare, a fost extras ARN-ul din exosomii izolați din liniile celulare de TNBC și fibroblaști. Cuantificarea ARN-ul s-a realizat folosind spectodotometrul nanodrop.
(3) Validarea profilului microARN-urilor prin tehnica qRT-PCR și identificarea unor potențiali biomarkeri de prognostic.
Ulterior, am evaluat genele care sunt modificate în același sens de achiziția rezistenței la doxorubicină în cadrul MDA-MB-231 și Hs578T. Impactul celor 31 de gene a fost evaluat mai departe în cadrul TCGA BRCA 2018 pentru a determina care din ele sunt asociate cu o modificare în același sens a intervalului liber de boală (DFS) rezultând într-un număr de 10 gene pe care le-am evaluat mai departe în STRING. Dintre aceste 10 gene, putem observa că doar CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL8, DUSP1, EGR1 și RRAD formează conexiuni în cadrul rețelei STRING. Luând în considerare literatura de specialitate, am observat că EGR1 este implicat în multiple procese de interes pentru cancerul de sân incluzând reglarea metabolismului și migrarea celulelor de cancer de sân. Astfel, am evaluat care microARN-uri țintesc EGR1 cu un nivel puternic de confidență și am observat că 4 microARN-uri îndeplinesc acest criteriu: miR-124-3p, miR-181a-5p, miR-183-5p și miR-191-5p. Aceste microARN-uri vor fi analizate la nivelul exosomilor izolați din liniile de TNBC sensibile și rezistente la doxorubicină, precum și din fibroblaști.
(4) Aprobarea Comisiei de Etică.
S-a elaborat documentatia corespunzatoare (protocol de lucru, template consimtamant informat, cerere tip pentru aprobare CE), conform procedurilor standard de operare ale universitatii, precum si a legislatiei internationale.
(5) Elaborarea planului de management al proiectului.
Principalele aspecte urmărite în cadrul planului de management realizat sunt: Monitorizarea desfășurării activităților conform propunerii de proiect, Identificarea decalajelor față de termenii de realizare și găsirea soluțiilor pentru diminuarea acestora, Monitorizarea respectării bugetului alocat prezentei etape, Comunicarea eficientă atât pe teme științifice cu mentorul, cât și pe teme administrative cu responsabilul financiar.
(6) Web site.
S-a selectat materialul de prezentare pentru pagina web a proiectului, ce va fi actualizată cu informații la fiecare etapă.
Etapa 2 (data etapă 31.12.2023) - Scurt raport 2023
• Evaluarea nivelului de expresie alterat a microARN-urilor exosomale derivate din liniile celulare de TNBC și fibroblaști, folosind platforma microarray.
• Determinarea efectului pe care îl prezintă fibroblastii asupra biologiei celulelor de TNBC sensibile la terapie, arătând modularea rezistenței la doxorubicină prin transferul exosomilor și a factorilor solubili secretați de fibroblaști în spațiul extracelular.
• Evaluarea transcriptilor non-codificatori alterați (microARN) la nivelul exosomilor izolați din plasma pacienților cu TNBC, ca markeri în predicția rezistenței la terapie. Aprobarea comisiei de etică. Managementul proiectului și diseminarea datelor.
Rezultate obținute în proiect. Etapa 2/2023
(1). Evaluarea nivelului de expresie a transcripţilor prin platforma microarray.
Analiza microarray s-a efectuat folosind Human miRNA Microarray Kit (versiunea 21.0; format, diapozitive 8x60LK). Probele au fost scanate folosind scanerul Agilent Microarray G2565BA (Agilent Technologies, Inc.). Analiza datelor a fost efectuată utilizând software-ul Feature Extraction (versiunea 10.7, Agilent Technologies, Inc.) și software-ul GeneSpring GX versiunea 12.6.1 (Agilent Technologies, INC.).
Folosind programul GeneSpring au fost evidentiate pentru fiecare condiție experimentală genele cu un nivel alterat, supra- și subexprimate. Astfel, au fost identificate următoarele:
1. pentru linia celulară Hs578T în co-cultura cu fibroblaști: 183 gene subexprimate și 486 gene supraexprimate.
2. pentru linia celulară Hs578T rezistentă la terapia cu doxorubicină în co-cultura cu fibroblaști: 417 gene subexprimate și 1405 gene supraexprimate.
3. pentru linia celulară MDA-MB-231 în co-cultura cu fibroblaști: 1778 gene suexprimate și 10588 gene supraexprimate.
4. pentru linia celulară MDA-MB-231 rezistentă la terapia cu doxorubicină în co-cultura cu fibroblaști: 1927 gene subexprimate și 13853 gene supraexprimate.
În urma analizei bioinformatice, s-a pus accentul pe șase gene cu nivel alterat de expresie: ABCB1, IL6, TGF-β1, CXCL11, ZEB1 și MALAT1.
(2). Validarea genelor cu nivel alterat prin tehnica RT-qPCR.
Următorul pas al acestei activități este evaluarea nivelului de expresie a genelor implicate în mecanismele de rezistență la terapie. Folosind metode de bioinformatică, au fost identificate genele cu nivel alterat de expresie. Dintre acestea au fost selectate ABCB1, CXCL11, IL6, TGF-β1, ZEB1 și MALAT1, fiind analizate în liniile de cancer de san triplu negativ, sensibile și rezistente la terapia cu doxorubicină, în co-cultura cu fibroblaști folosind tehnica RT-qPCR. În urma analizei RT-qPCR, au fost validate genele mai sus menţionate fiind semnificativ implicate cu precădere în mecanismele de rezistenţă la terapie. Persoanele diagnosticate cu cancer de sân prezintă o supraviețuire scăzută în cazul celor 6 gene identificate. Mai mult, nivelul de expresie analizat pe probe de pacienți, normal vs tumoră primară, arată o scădere semnificativă în cazul genei ABCB1, IL6 si ZEB1, în timp ce genele CXCL11, TGFB1 si MALAT1 prezintă un profil ridicat de expresie. Astfel, aceste gene pot să fie considerate biomarkeri specifici pentru partea de diagnostic și prognostic.
(3). Identificarea miARN-urilor implicate în modularea mecanismelor de rezinstenţă la terapie prin modularea genelor mai sus menţionate.
Pentru această activitate au fost selecționate 4 microARN-uri (miR-19b, miR-21, miR-125a, miR-155) care joacă un rol important în modularea rezistenței la terapie. Mai mult, miARN-urile selecţionate sunt ţinte directe a genelor mai sus menţionate. S-a observat o creștere a nivelului de expresie a miR-urilor investigate, fapt ce sugerează o activare a mecanismelor de rezistență la terapie. Mai mult decât atât, prezența micromediului tumoral (aici referitor la fibroblaști si exosomi) joacă un rol important în susținerea și activarea mecanismelor de rezistență la terapie prin intermediul diferiților transcripți și citokine. Folosind baza de date TCGA, s-a observat că persoanele diagnosticate cu cancer de sân prezintă o supraviețuire scăzută atunci când nivelul de expresie a miR-21 și miR-155 este supraexprimat. În ceea ce privește miR-125a, subexprimarea duce la scăderea semnificativă a ratei de supraviețuire. Astfel, aceste miARN-uri pot să fie considerate biomarkeri specifici pentru partea de diagnostic și prognostic.
Etapa 3 (data etapă 31.03.2024) - Scurt raport 2024
• Evaluarea transcripților non-codificatori alterați (microARN) la nivelul exosomilor izolați din plasma pacienților cu TNBC, ca markeri în predicția rezistenței la terapie.
Rezultate obținute în proiect. Etapa 3/2024
(1). Recoltarea şi procesarea probelor de sânge de le pacienţii diagnosticaţi cu cancer de sân.
După obţinerea consimţământului informat, probele de sânge au fost recoltate în tuburi cu anticoagulant (EDTA) şi procesat în următoarele 30-60 de minute de la prelevare. În urma procesării, plasma a fost obţinută şi stocată la -80 de grade până la realizarea investigaţiilor propuse.
(2). Izolarea şi caracteriazarea exozomilor izolaţi din plasma pacienţilor cu cancer de sân. Prin metoda ultracentrifugării, exozomii au fost izolaţi şi apoi caracterizaţi prin NanoSight şi microscopia de transmisie electronica. Cele două metode oferă informaţii despre dimensiunea acestor entităţii (< 200nm) precum şi morfologia caracteristică de “cup-shape”.
(3). Analiza miR-urilor în exozomii izolaţi din plasmă folosind tehnica RT-qPCR. După caracterizarea fizică a exozomilor, evaluarea miR-19b, miR-21 şi miR-125a a fost determinată. S-a observat o creștere a nivelului de expresie a miR-urilor investigate în liniile de cancer de sân, fapt ce sugerează o activare a mecanismelor de rezistență la terapie, sugerând activarea diferitelor procese biologice (creştere tumorală, invazie, metastazare). Mai mult decât atât, prezența micromediului tumoral (aici referitor la fibroblaști si exozomi) susține și activează mecanismele de rezistenţă la terapie. Astfel, aceste miARN-uri pot să fie considerate biomarkeri specifici pentru partea de diagnostic și prognostic.
Impactul rezultatelor obținute
Proiectul propus se bazează pe evidențierea modificărilor la nivelul comunicării dintre celulele de TNBC și fibroblaști în contextul rezistenței la doxorubicină. Prin identificarea căilor de semnalizare implicate în modularea acestui proces, putem determina molecule cheie care să ajute la prezicerea activării mecanismelor de rezistență la terapie. Mai mult, identificarea profilului alterat al microARN-urilor la nivelul acestui tip de cancer poate duce la identificarea de noi biomarkeri pentru prezicerea aceste afecțiuni maligne.
Diseminarea rezultatelor cercetării
Articolul a fost publicat în jurnalul Translational Oncology - https://doi.org/10.1016/j.tranon.2024.101951
Contact
CSIII Dr Jurj Maria-Ancuta
Universitatea de Medicină și Farmacie “Iuliu Hațieganu “, Cluj-Napoca – RO, Departament – Centrul de Cercetări pentru Genomică Funcțională, Biomedicină și Medicină Translațională
E-mail: